Grunnábendingar til að verja frumu ræktunar

Grunnábendingar til að verja frumu ræktunar

Frumur halda áfram umbrotum við venjulega vaxtarstarfsemi, sem krefst þátttöku ýmissa próteasa. Þegar hitastigið lækkar undir -70 ° C hætta próteasar að virka. Þess vegna, í umhverfi með mjög lágt hitastig, geta frumur stöðvað efnaskiptavirkni sína og farið í sofandi ástand sem gerir kleift að geyma langtíma.

1. Tilraunaefni

Grunnefni:

Grunnmenningarmiðill

Sermi (hefðbundin FBS/NBS)

Ultrarapure Workbench

Dauðhreinsað dímetýlsúlfoxíð (DMSO)

Sæfð PBS fosfatjafnalausn

Pipetting byssu

Rafmagns pipetting byssu

Undirbúningur tilrauna

a) Undirbúningur frystingarlausnarinnar:

Almennar frumur: 55% basal miðill + 40% nautgripasermi (FBS/NBS) + 5% DMSO

Mikilvægar frumur: 90% nautgripasermi (FBS/NBS) + 10% DMSO

Skammturinn tilbúna kjölverndarlausn í 15 ml skilvindu rör [hreiður] og geymdu við 4 ° C til síðari notkunar.

(b) Undirbúningur frumna til að frosinn:

Áður en frumurnar frysta, velja frumur með góða vaxtarstöðu og í lógaritmískum vaxtarstigi og skipta þeim út fyrir ferskan miðlungs 12-24 klukkustundir áður en frystingu til að viðhalda frumuástandi.

2. Tilraunaaðferð

1. Fylgstu með þéttleika frumanna sem á að frysta, sem er um 80%~ 90%. Notaðu pípettubyssu til að sogast á gamla miðilinn, bæta við dauðhreinsuðum PBS til að þvo frumurnar 1-2 sinnum og fjarlægja þann miðil sem eftir er í ræktunarumhverfinu.

2. Bættu við viðeigandi magni af trypsíni eða meltingarafa til að leyfa trypsíninu að komast inn í frumurnar og setja þær í útungunarvélina til meltingar. Fylgstu með ástandi frumanna undir smásjánni: umfrymið dregur aftur og frumurnar eru ekki lengur tengdar í blöð. Bættu við stöðvunarlausninni á þessum tímapunkti til að stöðva meltingarferlið.

3. Bubbaðu varlega frumurnar með þjórfé til að mynda frumusviflausn og skilvindu frumusviflausnina við 1000 snúninga á mínútu í 3-5 mínútur.

Fleygðu flotinu, bættu við viðeigandi magni af frysting og varlega pípettu til að láta frumurnar telja jafnt. Stilltu frumuþéttleika með kjölverndarmiðli til að gera lokaþéttleika 5 × 106/ml ~ 1 × 107/ml.

4. Notaðu pípettubyssu til að aðgreina kryógenrör í samræmi við væntanlega getu og notaðu sjálfvirka lokunarvél til að hylja og innsigla.

5. Hið staðlaða kjölverndaráætlun er kælingarhraði -1 ° C til -2 ° C/mín. Og hægt er að frysta frumurnar sem á að frosnar eftir eftirfarandi skrefum: stofuhita → 4 ° C (20 mín) → - 20 ° C (30 mín) → -80 ° C ° C (yfir nótt) → langtíma geymsla í fljótandi köfnunarefni.

Það er einnig hægt að geyma það beint í frysti við -80 ° C yfir nótt og síðan flutt yfir í fljótandi köfnunarefni til geymslu.

Yongyue Medical er hátæknifyrirtæki sem sérhæfir sig í R & D, framleiðslu og sölu á lífeðlisfræðilegum rekstrarvörum. Pipette ábendingar, pípettur, PCR plöta, frumuræktarafurðir og aðrar líffræðilegar rannsóknarstofur. Yongyue Medical er verðugt traust þitt og val! Verið velkomin að ráðfæra sig við!